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实验记录--成人骨细胞的分离培养

1、 材料与方法

1.1 成人组织标本

  成人骨组织块来取自武汉大学人民医院骨科股骨颈骨折行髋关节置换手术的中年患者,标本离体后置于无菌盐水中,于1~8 h内完成骨细胞的提取步骤。人体标本取材通过武汉大学人民医院伦理委员会批准。

  1.2 主要试剂

  Ⅰ型胶原酶、Ⅰ型鼠尾胶原蛋白、EDTA溶液、Hank's缓冲液(HBSS)、α㎝EM培养基、DMEM高糖培养基、小牛血清、胎牛血清、1%牛血清白蛋白BSA、0.25%胰蛋白酶〦DTA消化液、青霉素 、染色试剂盒、E11/GP38抗体。小鼠胚胎成骨细胞前体细胞系(MC3T3〦1)。原代骨细胞培养基配制:α㎝EM培养基+5%小牛血清+5%胎牛血清+1%青霉素C3T3培养基:DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%青霉素

  1.3 主要仪器

  二氧化碳恒温培养箱、外科手术器械、超净工作台、倒置显微镜及拍摄系统、正置荧光显微镜及拍摄系统。

  1.4 实验方法

  1.4.1 细胞培养

  1.4.1. 1 骨细胞的分离与培养

 分离培养骨细胞,具体步骤:(1)取股骨颈下骨组织块,置于含有10%青霉素㎝EM培养基中,尽可能地剔除骨膜及其他软组织并重复冲洗骨髓面。(2)用HBSS洗3遍后,将骨组织切成约1 mm×1 mm的小块。(3)加入实验前配好的2 mg/mLⅠ型胶原酶,于细胞培养箱中消化25 min后弃掉消化液,HBSS洗3次。(4)重复步骤(3)2遍。(5)加入含有1%BSA的0.02%EDTA溶液,置于细胞培养箱中25 min,弃掉上清液,用HBSS洗3次。(6)重复步骤(3)。(7)重复步骤(5)。(8)重复步骤(3)。(9)重复步骤(5)。(10)加入2 mg/mLⅠ型胶原酶,细胞培养箱中消化25 min,HBSS洗3遍后收集清洗液与上清液,1 200 r/min离心5 min,离心后弃上清,培养基重悬后同消化后的骨组织种植于包被有Ⅰ型鼠尾胶原蛋白的6孔板中,加入3 mL配好的细胞培养基于细胞培养箱中培养。5 d后换液,以后2~3 d换液一次。

  1.4.1. 2 MC3T3〦1培养

      按照细胞说明书培养:细胞用T25培养瓶复苏后,2~3 d换一次液,待细胞融合度达80%左右进行1∶3传代培养,传代培养2~3代后,取生长活力好的细胞进行实验。

  1.4.2 骨细胞的鉴定

  1.4.2. 1 形态学观察

  细胞贴壁后,将培养板置于倒置显微镜下进行观察、拍照。

  1.4.2. 2 E11/GP38荧光染色

  (1)制作细胞爬片,细胞贴壁后吸弃培养基,用PBS洗3次,每次3 min。(2)用4%多聚甲醛固定爬片15 min,PBS洗3次,每次3 min。(3)0.5%TritonX〡室温通透20 min,PBS洗3次,每次3 min。(4)10%的山羊血清室温封闭45 min。一抗4℃孵育过夜。(5)PBS洗3次后,加入荧光二抗室温避光孵育1 h。(6)PBS洗3次,每次3 min,DIPA复染核5 min。(7)PBS洗3次后滴加含抗荧光猝灭剂封片液封片,荧光显微镜下观察。

  1.4.2. 3 ALP染色

  按照试剂盒操作。具体步骤:(1)按试剂盒配好工作液A、B、C。(2)细胞爬片PBS洗3次,每次2 min,用4%多聚甲醛固定10min。(3)加入A液于37℃恒温箱中孵育1 h,PBS洗3次,每次2 min。(4)加入B液作用5 min,PBS洗3次,每次2 min。(5)加入C液作用60 s,PBS洗3次,每次2 min。(6)中性树胶封片,正置显微镜下观察。

2、 结果

      2.1 形态学观察

  MC3T3〦1细胞形态多为三角形或梭形(图1A)。分离出的绝大多数骨细胞形态呈星形,并从胞体发许多出树枝状突起与相邻细胞相联系,极少数细胞长条形(图1B)。

  2.2 ALP染色

  ALP染色结果显示,分离所得的细胞呈阴性或弱阳性反应(图2A),MC3T3〦1细胞呈阳性反应(图2B)。

  图1 倒置显微镜下观察细胞形态(×100)   下载原图

  A.MC3T3〦1细胞;B.分离出的细胞

  2.3 E11/GP38荧光染色

  E11/GP38是骨细胞早期表达的标志蛋白,荧光染色结果显示分离出来的细胞呈强阳性(图3A、3B、3C),而MC3T3〦1细胞呈弱阳性(图3E、3D、3F)。

  图2 正置显微镜下观察ALP染色结果(×200)   下载原图

  A.分离出的细胞;B.MC3T3〦1细胞

  

  图3 细胞E11/GP38荧光染色(×100)   下载原图

  A、D:DAPI示细胞核;B、E:E11/GP38荧光染色;C、F:叠加图像

3 、讨论

      成人骨组织主要由成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和细胞外基质组成。骨细胞是成熟骨组织中含量最多的细胞,具有重要的生物学功能。如在儿童骨骼发育、成人骨折愈合过程中,骨细胞能够感受骨组织应力,通过其丰富的树突与骨组织表面的破骨细胞和成骨细胞相联系,调节其功能,参与骨生长和骨重建[14]。目前,关于骨组织的研究报道主要集中于成骨细胞,而对骨细胞与破骨细胞的文献报道相对较少。这主要是原因在这三种细胞中,体外成骨细胞的分离培养更容易,而其他两种细胞的体外分离培养则相对较难。虽然目前有多种骨细胞系模型可供研究者选择,但是和原代细胞相比较,细胞系只表达原代细胞某一时期或者某一方面的特征,并不能完全表达原代细胞的所有特征。因此,能够分离培养出原代骨细胞对于骨细胞的研究具有非常重要的意义。但由于骨细胞深埋于钙化的骨组织中,体外分离骨细胞变得十分困难。本实验在参考前人的基础上对成人骨细胞进行体外分离培养与初步鉴定。

  骨细胞由成骨细胞分化而来,在形态学及生物学功能存在差异。骨细胞在成熟过程中,表面形成了许多长的突触,该突触在细胞贴壁后显微镜下观察呈星形、多树突状,而成骨细胞与破骨细胞则不表现此种形态。因此,通过这种形态差异可鉴别骨细胞与骨组织其他细胞[12]。本实验结果可以看到分离所得的细胞表现出骨细胞的多树突状形态,树突长短不一,相邻细胞间的树突相互连接,这和成熟骨细胞在骨组织中通过骨小管相互连接的形态非常相似。此外,分离所得到的细胞大小不一,这可能是因为细胞处于不同的分化状态。碱性磷酸酶(ALP)是细胞膜表面的一种钙转运蛋白,具有促进细胞成熟、钙化,该蛋白酶在成骨细胞表达量最多,随着成骨细胞向骨细胞分化成熟,其表达水平显著降低[15]。因此检测细胞中的ALP可以鉴别成骨细胞与骨细胞。本实验ALP染色结果显示分离所得的细胞ALP染色与成骨细胞系MC3T3〦1存在明显差异,染色结果支持分离所得细胞为骨细胞。E11/GP38是成骨细胞向骨细胞分化过程中早期骨细胞表达的特异性蛋白,E11/GP38染色可鉴定骨细胞[16]。本实验通过免疫荧光方法检测了该蛋白在分离所得细胞与MC3T3〦1细胞的表达状况,结果显示在分离所得细胞中该蛋白表达信号强烈,而在MC3T3〦1细胞表达信号微弱。说明实验中分离所得细胞为骨细胞。

  虽然本实验分离出了具有骨细胞形态的原代细胞并做了初步鉴定,但还存在许多不足之处。如在实验中,细胞主要是在二维环境培养的,而骨细胞的生长环境是一个立体的三维空间,如果能在三维空间成功培养骨细胞,则分离出来的细胞更能表达骨细胞的特性。此外,使用该方法分离细胞存在耗时长、操作步骤复杂等问题,在细胞培养过程中,如操作不慎,很容易出现病原体污染,导致实验失败。因此还需要研究探索出更好的分离方法。

  总之,骨细胞作为一种具有重要的生物学功能的细胞,如能够在体外将其分离出来,将极大促进骨细胞的研究。由于原代骨细胞提取困难,大多数研究者都选择成骨细胞或者骨细胞系进行研究,有关原代骨细胞的研究非常少。因此探索体外稳定的原代骨细胞分离提取方法,将为骨细胞的进一步研究提供良好的基础。


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